净水技术|饮用水生物安全现状、评价方法及对策措施
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陈晓1,2，汪毅1，丁志斌1，李伟英3，4，赵小兰1，连小莹1
(1.陆军工程大学，江苏南京 210007；2.32144部队，陕西渭南 714000；3.同济大学环境科学与工程学院，上海 200092；4.同济大学长江水环境教育部重点实验室，上海 200092)
饮用水的生物安全日益引发关注，与化学安全共同被视为水质安全的基本要求。饮用水生物安全是指所有由微生物（包括病原体）引起的水传播疾病与水质恶化问题。细菌在输配水系统中会发生显著增长，并可能导致卫生、感观或运行问题。
世界卫生组织指出，进入输配系统的饮用水必须在生物上是安全的，在理想情况下也应该是生物稳定的。生物稳定是指水中有机营养基质作为生长限制因子时，异养细菌生长的最大可能性。生物稳定的水中，在一定的停留时间内，细菌生长衰亡处于动态平衡，不会发生明显增长。
1 | 饮用水生物安全问题 |
饮用水生物安全问题主要有：细菌失控繁殖、致病菌引发传播疾病、感观恶化、生物膜生长及生物腐蚀、生物多样性变化导致环境耐受力下降、抗性细菌与抗性基因传播。
1.1 | 细菌失控繁殖 |
饮用水本身存在细菌不一定是问题，只要不存在致病微生物，即细菌数量相对较多（103~106 cells/mL），对人体健康没有影响。然而，饮用水中细菌失控繁殖会导致输配、贮存过程中水质恶化。
输配水系统存在持续的营养来源与消耗（与消毒剂反应、细菌利用），细菌失控繁殖会消耗大量营养基质，水的细菌增长潜力下降，生物稳定性增强，但增加了生物安全风险。对于水力停留时间较长的贮存水，初始阶段细菌在生长期快速消耗营养，细菌生长潜力下降，生物稳定性增强；进入衰亡期后细菌生长呈震荡下降趋势，并缓慢趋于生物稳定。
1.2 | 致病菌及致病生物 |
水中存在的机会致病菌（如铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、分枝杆菌、某些大肠杆菌等）在增殖到一定浓度后会引发传播疾病。致病菌主要通过寄生方式生存，能够在低营养浓度条件下生长。某些原生动物，如阿米巴原虫、隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫也具有致病性。在我国，饮用水中出现频率较高的致病菌是嗜肺军团菌与禽结核分枝杆菌。
1.3 | 水的感官恶化 |
非致病性细菌过度生长，会引起水的感官恶化。细菌在颗粒、沉积物或生物膜上附着，悬浮颗粒增多，引起水浑浊或变色：如管道中因腐蚀、氧化产生的铁颗粒和锰沉淀会使水变为红色或黑色。特定细菌产生影响水的味道和气味物质的分子：如放线菌会产生土臭素散发泥土的气味，参与硫循环的细菌可以促进硫磺气味，此外，酵母、真菌和藻类等生物也会散发特殊的味道和气味。
1.4 | 生物膜及生物腐蚀 |
管道内生物膜生长会造成水体污染与水的流动阻力，并对管道造成腐蚀。生物膜是微生物细胞的聚集体，通常聚集在固-液界面并包裹在高度水合的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）基质中。EPS结构可避免消毒剂与捕食者对菌体的伤害，并不断结合有机和无机化合物。生物膜为致病菌生长提供良好环境，并间歇向流动水中释放细菌造成水质恶化。生物膜在管道上附着结垢、发生氧化反应造成或促进管道、构筑物腐蚀。
1.5 | 生物多样性变化 |
在不同水处理工艺的筛选过程中，水的生物多样性趋向单一化，对环境耐受力逐渐下降。LING等对贮存水中的生物多样性变化的研究表明，贮存水随着水力停留时间的增长，出现了α变形菌占比下降、β变形菌上升，γ变形菌在生物膜中的比例有显著的增加的现象。其研究表明，β变形菌与γ变形菌的富集与水质恶化有一定的相关性。
1.6 | 抗性细菌与抗性基因传播 |
为了控制饮用水管网中的细菌再生长，国内外广泛使用含氯消毒剂对饮用水进行消毒处理。但一部分耐氯性细菌仍能在余氯浓度较高条件下存活，如产粘液分枝杆菌、鞘氨醇单胞杆菌和藤泽式甲基杆菌。
抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)是水环境中的新型污染物。近些年来，抗生素长期大量、不合理使用，使环境中细菌耐药性增加， 导致环境介质中ARGs和抗生素抗性细菌(Antibiotic resistance bacteria， ARB)残留。抗生素抗性细菌和抗性基因在环境中的停留时间较抗生素更长，并且会在不同环境介质中进行传播，往往比抗生素本身对环境的危害更大。
综上，如图1所示，水的生物安全风险起于细菌失控繁殖，并相互影响，根源在于营养基质与生长抑制物质的失衡。生物稳定性的本质在于控制营养基质，限制细菌生长，从而保证水的生物安全。
2 | 饮用水微生物动力学 |
如图2所示，营养物质、生长抑制物质、微生物等因素相互作用，共同影响着饮用水生微生物动力学动力学变化。
2.1 | 营养组成和浓度的影响 |
饮用水中物质的组成和浓度会限制或促进水中细菌的生长，其中有机和无机营养物质的浓度决定了细菌生长程度。饮用水中大部分细菌是异养生物，有机碳通常是生长限制性化合物，磷、氮或微量元素（铁，镁，铜，钾）等无机营养素则是异养生长所必需的，但其含量远低于有机碳。当前研究主要集中在有机碳的限制作用上，尚不清楚饮用水系统中无机元素对细菌生长的限制，包括磷酸盐限制以及其他因素。
竞争是细菌之间复杂的相互作用，受营养成分和水中比例、物理化学参数（如水温或pH）以及个别物种的特定动力学能力控制。营养物质的组成和浓度决定生态位，在这个生态位中，基质利用谱上有重叠的细菌将竞争可用基质。
饮用水中的复杂营养组成有助于提高细菌群落的多样性，高丰富度和均匀度的细菌群落可抵抗侵入性细菌物种的生长竞争压力，即使在低营养环境中依然保有生存和增殖能力。
2.2 | 生长抑制物质的影响 |
消毒剂等抑制物质的使用是保持生物稳定性，降低生物安全风险的核心问题。近十年来，抑菌剂和无机、有机、天然、复合抑菌材料的研究应用发展迅速。银系无机抑菌剂、纳米银抑菌材料、Ag-TiO2抑菌颗粒材料、壳聚糖(CTS)-聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 复合材料、KDF铜锌合金等新型材料在研究应用中表现出了较好的抑菌效果。
GILLESPIE等研究表明，饮用水中游离氯浓度低于0.5mg/L时，细菌细胞可保持较好完整性。为控制饮用水中微生物增殖，通常是过量投加消毒剂，目前最为普遍的消毒方法为氯消毒。但超氯消毒不可避免增加了消毒副产物的风险，加剧了对贮水介质的电化学腐蚀。同时，超氯消毒对饮用水口感会产生不良影响，CRIDE等的研究表明，当水体中自由氯浓度超过0.7 mg/L时，受用者会感受到明显的味道，其最大接受浓度为2 mg/L。因此，消毒剂等物质必须保持在合理范围。
消毒剂阈值浓度取决于水中基质浓度和使用的消毒剂种类。根据Monod与Chick-Watson 动力学模型（式1）以及KOOIJ、SHARP等研究表明，通过降低水中营养物质浓度可以相应降低消毒剂阈值浓度。LECHEVALLIER 等研究表明，AOC浓度高于100 µg/L的水中，游离氯浓度低于0.2 mg/L或氯胺浓度低于0.5 mg/L时，大肠杆菌会再生长。
消毒剂的种类与浓度影响细菌群落的组成和结构。以氯胺为例，铜绿单胞菌属和嗜酸菌属对一氯胺最敏感，而土杆菌属或军团菌属具有高抗性。同时，氯胺也被证明可以促进特定细菌（如硝化细菌）的生长。总体而言，氯化反应后各系统细菌群落变化及细菌多样性降低，而单一消毒剂的使用会导致水体生物多样性下降以及抗性基因、耐氯细菌等的出现。因此，联合消毒方法与新型消毒剂的研究具有较好的应用前景。
2.3 | 其他微生物在饮用水中的作用 |
除细菌之外的其他生物（例如，原生动物，无脊椎动物，病毒）对细菌生长的控制情况仍不清楚。细菌是饮用水中营养链的起点，并受到生物体的捕食，如原生动物，而原生动物又是无脊椎动物的目标。原生动物的选择性捕食可能会影响细菌丰度和群落组成。饮用水系统中原生动物的存在浓度范围为5×104~7×105个原生动物/ L，并且与细菌的存在有关。此外，原生动物和无脊椎动物都会排泄无机和有机营养物质，这些营养物质可被细菌利用，从而改变细菌生长所需的营养构成。
2.4 | 细菌在水、沉积物和生物膜中的分布 |
细菌在悬浮相、沉积相、附着相之间的相互作用仍不清楚。生物膜长期以来被认为涵盖了饮用水中最大部分（高达95％）的细菌细胞。最近的一项研究表明，98％的细菌细胞位于生物膜和沉积物中，其中60％~90％实际位于沉积阶段。EPS产生的沉积物与生物膜的营养构成得到丰富，产生了新的生态位从而增加了生物多样性。生物膜的分离和沉积物的重新悬浮可能会导致水中的细菌细胞浓度和群落组成的大幅变化；此外，生物膜和沉积物中的细菌细胞将与水中细菌竞争可用的营养物质。LIU等对细菌群落的OTUs (Operational taxonomic units，基于序列间相似度的分类单元)研究表明，生物膜中约12%的菌群在原水中是不存在的。细菌群落在悬浮相和附着相之间的转移进一步受到饮用水分配管网材料的影响。MARTINY等研究表明，幼龄生物膜表现出与水体细菌群落相似的特性，而成熟生物膜表现出较低的生长速率和较低的群落结构。管道及贮存容器材料组成也会影响生物膜的发育。
沉积物形成是在有利水力条件下颗粒沉积的结果，管网中松散沉积物多达3000mg/m。沉积的颗粒通常由有机化合物与无机基质（如Ca，Fe，Mn）组成，具有较大表面积，有利于细菌生长。LIU发现沉积物可能有利于特定细菌生长，例如参与铁和砷循环的土杆菌属等。颗粒、生物膜、EPS相结合巩固沉积物结构，即使在高水力峰值期间沉积物不会重新悬浮。在沉积物膨胀期间，可能会产生缺氧或厌氧条件，造成新的细菌出现。
因此，配水系统的水力变化频繁，在水、沉淀物和生物膜之间的相互作用中起着重要作用。
3 | 饮用水生物安全评价方法 |
3.1 | 直接变化指标 |
细菌数量的增加是生物安全风险上升的明显标志，可以用特定细菌、细菌群或总细菌群落的变化来衡量。特异性检测传统上是在选择性培养基上进行培养，特别是对于致病菌的检测，最新应用则是通过qPCR（quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶链反应）或特异性抗体等检测技术进行。
3.1.1 | 荧光技术与流式细胞术 |
基于荧光技术的ATP法可对水中生物量做出快速检测。基于荧光染色的流式细胞术替代了原有平板计数法，实现了细菌绝对计数与不可培养细菌计数。
3.1.2 | 高通量测序 |
借助于分子生物学，可以实现在遗传水平上对微生物物种多样性的研究，从而推断微生物的种群结构与功能。如基于16S rRNA（细菌染色体上编码 rRNA相对应的DN A序列，存在于所有细菌的染色体基因组中）的高通量测序技术与qPCR技术可获取原核生物丰富的基因序列，对复杂水样中的微生物群落的多样性与丰富度进行分析。利用高通量测序也可以对水处理工艺中微生物群落变化、致病菌检测、生物膜的形成与变化等实现精确分析。
3.1.3 | 宏基因组学 |
宏基因组学( metagenomics)是研究宏基因组的重要学科。它将所有微生物研究对象视为一个整体，利用分子生物学技术，在基因组的水平和微生物群落的水平上，对其进行统一检测、分析，研究微生物、生物体、水环境之间的关系。宏基因组学可直接测定样品中所有微生物的核酸序列，而不需筛选各微生物群落的纯培养物。
3.2 | 预估方法 |
从本质上说，这些方法是预估性的，因为水是在分配前分析的，这些测试是用来预测在分配贮存过程中可能发生的细菌再生长情况，用于指导后续的消毒工艺。
3.2.1 | AOC/ BDOC |
AOC（assimilable organic carbon，可同化有机碳）法是基于荧光假单胞菌P17 (Fluorescent Pseudomonads)和一种螺旋菌NOX ( spirillum )对水中能被细菌快速利用的有机物进行检测。BDOC（biodegradable organic carbon，生物可降解溶解性有机碳）测定的具体方法：待测水样首先经膜过滤去除微生物，然后接种一定浓度的土著细菌，20 ℃培养28 d，前后DOC差值即为BDOC。
3.2.2 | BRP |
细菌再生长潜力（Bacteria Regrowth Potential, BRP）是SATHASIVAN等提出的一种生物稳定性评价指标，该方法以水样土著细菌为接种菌种，以接种水样培养后的最终细菌数表示水体支持细菌再生长的潜力，可表征碳以外其他化合物对微生物生长起控制作用(如有机碳、铵、锰、铁、磷等)。
3.2.3 | cDNA |
cDNA是基于RNA-seq在Illumina平台测序分析真菌内部转录间隔区(ITS2)，标记细菌群落中新陈代谢活跃群落，从RNA中把mRNA分离出来并且通过酶切打断，然后反转录为双链cDNA并末端修复，PCR 扩增而后纯化，进行深度测序。cDNA用于预估细菌群落中最有可能出现明显再生长的细菌群落，对指导相应的水处理策略更具有针对性。
4 | 水质生物安全的处理策略 |
水质生物安全处理策略要适应原水的特性，而原水的特性可能非常多样化。深层地下水通常含有非常低的细菌细胞浓度（103~104 cells/ mL），通常是厌氧环境且含有低有机营养素（例如，AOC低于10 μg / L），但可能含有较高的甲烷和铵浓度。地表水通常含有高细菌细胞数（105~106 cells/ mL）和相对高浓度的有机物（例如，AOC在5~150 μg/ L范围内）。处理策略旨在灭活致病微生物，去除微污染物与ARGs，改善感观指标（浊度、味道和气味），并防止水分配与贮存过程中的细菌生长。水处理策略决定了有机和无机营养的组成和浓度，以及细菌群落特征（丰度、活性、群落组成）。
表1为不同处理策略对生物安全及生物稳定性的影响。深度处理技术在很大程度上满足水厂出水水质生物安全的要求；但在输配过程中，随着水力停留时间增长与消毒剂衰减，细菌再生长，生物安全风险上升。因此需要尽可能保证水从源头到龙头的生物稳定，使细菌生长保持可控，特别是在二次供水阶段，在供水末端，应兼顾水的生物安全与化学安全。
表 1 不同处理策略对生物安全及生物稳定性的影响
此外，探索优化高效去除水中ARGs的方法与处理工艺应是今后研究的一个重要方向。ARGs去除的主要技术有消毒技术、氧化技术（Fenton氧化、光催化氧化）以及膜技术（其中超滤膜对ARGs去除效果显著）。
5 | 结论 |
保证水的生物安全是水务领域的重要目标。
（1）水的生物安全风险主要是细菌失控繁殖以及由此引发的传播疾病爆发、感观恶化、生物膜及生物腐蚀、生物多样性变化以及抗性基因传播。
（2）从动力学角度分析，水的生物安全可通过控制营养基质、抑制剂以及水利条件实现。细菌在悬浮相、沉积相及附着相的动力学知识仍待进一步研究。
（3）水的生物安全通过直接指标与预估方法进行评价。流式细胞术、高通量测序等新兴的分析方法，为提高对饮用水生态学、动力学认识开辟了新途径。
（4）深度处理技术可很大程度上降低水厂出水生物安全风险，但通过组合工艺保证水从源头到龙头的生物稳定以及抗性基因的去除是今后研究的重要方向。
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